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1,DNA抽出（フェノクロ抽出)
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100 μl Tail bufferを入れたチューブに指を切り入れていく。
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50℃でインキュベートを行う。（途中混和すれば2時間程度でも構わないが基本はO.N.）
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100 μl フェノクロ液（下層）を入れ、ボルテックスし遠心する。（15,000 rpm, 5 min, 4℃）
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中間層のタンパク質（白い沈殿物）が入らないように上層を取り、100％ EtOH（250μl）へ入れる。（このときは新しいチューブを用いる）
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攪拌すると、白い沈殿物が現れるがその綿状のものが核酸である。
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遠心。（15,000 rpm, 10 min, 4℃）
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EtOHをキレイに全部捨て、70％ EtOHを入れ遠心。（15,000 rpm, 3 min, 4℃）
EtOHを捨て、室温にて約5-10分間乾燥させる。
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乾燥後TEを150 μl入れ、4℃で保存。
2. PCR
| 10. |
下記に記したpolymerase Taq.以外の試液を氷上もしくは室温にて融解させる。 |
| 11. |
使用する本数分のバッファーを調整するが、足りなくことも考えられるため一本多めの量で調製する |
| 12. |
融解したら、水→PCR buffer→dNTP→primerの順に新しいチューブへと入れていく。（これらは何れもボルテックスにより混和した後加えること） |
| 13. |
これら全てを入れた後、ボルテックスにより混和→スピンダウンを行う。 |
| 14. |
この後に、Taqを入れる。（Taqは極力熱にさらすことを避ける） |
| 15. |
PCRチューブへと12.5 μlずつ分注する。（PCRチューブにはフタ、本体ともに番号を書いておくこと。また種類により色を使い分ける |
| 16. |
PCRチューブにバッファーを分注した後、DNAを0.5 μlずつ加える。（DNAもボルテックスを行ってから加えること） |
| 17. |
その後、スピンダウンしサーマルサイクラーへ。 |
| genotype PCR |
volume（μl） |
10 x PCR
buff.
2.5 mM dNTP
primer ①
②
Taq.
H2O
DNA
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1.25
1
0.5
0.5
0.065
9
0.5 |
| Tail buffer （10ml） |
1 x SSC
10 mM Tris (pH 8.0)
20 mM EDTA
1% SDS
H2O
ProK (0.5 mg/ml)
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500
μl（x 20）
100 μl（1 M）
400 μl（500 mM）
1 ml（10%）
7.5 ml
500 μl（10 mg/ml）
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