海馬神経初代分散培養法

Culture Medium :
　50 ml Neurobasal Medium
　1 x B-27 supplement
　0.5 mM glutamine
　1/200 penicillin-streptomycin

Dish Coating :

  1. laminin(5 μg/ml)、poly-D-lysine(50 μg/ml)でコーティングを行い、37℃で一晩インキュベートする。
  2. ディッシュを滅菌水により3回洗浄し、4-7時間程度インキュベートする。
    （乾燥しすぎはダメ。乾燥後は冷蔵庫にて1-2週間保存可能）
    （ガラス製の場合は1N NaOH→Milli Q→1N HCl→MilliQ→75% EtOH→100% EtOHの順で洗浄してからコーティングを行う。）

Papain Solution（pH 7.4）:
10-15 units/ml papain
0.45 mg/ml L-cystein hydrochrolide
0.01 % DNaseI 　　　　　　　 in PBS

Neurobasal Medium
glutamine
B-27
laminin
poly-D-lysine
DNaseI
papain
L-cystein hydrochrolide
Ara-C
GIBCO（21103-049）
GIBCO（21051-024）
GIBCO（17504-044）
BD（354232）
BD（354210）
Wako
Worthington（37A9379）
SIGMA（C7880-100G）
SIGMA（C5545-5G）
Preparation protocol :
1） 直前にL-cystein hydrochrolideを4.5 mg/10 ml（pH 7.4）に調整し（調整前はpH 6.7くらい。9μl(4 N NaOH)/10mlで調整するとよい。）、papainを15 units/mlで加える
2） パパイン溶液を37℃、５分で溶解後、フィルター滅菌を行い使用するまで氷上で保存。
3） 当日生まれた新生児に75％ EtOHを吹きかけ消毒し、海馬をice cold PBS中で取り出す。
4） 取り出した海馬はice cold PBSが入った15 mlチューブへ。
5） 全ての海馬を取り出した後、ice cold PBSで上清をピペットで捨て、新たなice cold PBSを加える。この操作を3回程度行う。（Wash）
6） 以下の操作は、室温でよい。
7） パパイン溶液へ海馬を入れ、37℃で15-30分間インキュベートする。
8） このインキュベート中にパスツールピペットの先端をバーナーで焼き、穴を小さくしたものを作製する。（穴の大きさは、大きめと小さめの2種類を作製）
9） インキュベート終了後、PBS中へ海馬を入れ３）の操作を同様に行う。（Wash）

10）

 メディウムの入った15 mlチューブへ海馬を入れ、まず大きめの穴でできたパスツールで懸濁を行い、ある程度細胞をバラバラにする。その後、小さめのパスツールで更なる懸濁を行い細胞を単離する。
11） 細胞数を計数し、目的に応じた濃度に希釈する。
12） 330 μl 程度の量で播種しディッシュに細胞を接着させる（24 well dish）。
13） 2-3時間後、500 μl のメディウムを加える。
14） 2-3日後、終濃度5-10 μM となるようにAra-Cを加える。
15） 様子を観察しながら5-7日程度毎にメディウムを半分量ずつ置換する。

Notice:
    • やさしく素早く行うことが重要。
      （生後24時間以内であれば特に問題はないと思われるが、胎生時に行うのが望ましい）

    Ref.:
    Free Radical Biology & Medicine, 28, 5, 665-672 (2000)
    J. Neurosci Res., 71, 811-818 (2003)
    J. Neurosci. Meth., 149, 110-120 (2005)
    日薬理誌, 119, 163-166 (2002)
    実験医学, 20, 15 (10月号, 2002)
    脳・神経研究の進め方, 羊土社, 53-58

    MAP2（神経細胞特異的マーカー）による免疫染色（培養18日後）


 
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