マウスを頚椎脱臼後、後肢を切り落とす。

皮をはぎ、筋肉を露出させる。

筋肉にくっついた毛を取り、軽く膜をはぐ。

Total muscleとして大腿筋の一部を取る。エッペンに入れ、液体窒素へ。

肢を裏側にしてピンでシャーレに止める。

慎重に筋肉をはいでいき、ヒラメ筋(Soleus)を露出させ、腱から腱までを摘出する。

両足のヒラメ筋を摘出しエッペンに入れた後、液体窒素へ。

次は肢を表側にしてすねの筋肉を一枚はぐと、長指伸筋(Extensor digitorum longus; EDL)を露出させる。

腱から腱までを摘出する。両足をエッペンに入れ、液体窒素へ。

摘出した筋肉の両足分をまとめて1つのエッペンチューブに入れ、重さの10倍量のhomogenize buffer(protease inhibitor cocktail + PMSF + DTT 1 ml/ml)を加える(重さを量る際は、キムワイプで水分を吸い取り、あらかじめエッペンの重さを量っておいてから組織重量を測る)。

Homogenize bufferを加えた後、ポッター型orテーパー型ホモジナイザーによりホモジナイズする。

エッペンチューブに移し変え、8000 rpm 10 minで遠心する。

上清を別のエッペンに移し、それを用いてウェスタンブロットを行う。

Bradfoed法によるタンパク定量を行い、含有タンパク量を吸光度により測定する(検量線にはBSAを用いる)。

タンパク定量後、2xsample buffer (レムリーbuffer)を等量加えてSDS-PAGEを行うが、1 wellにつき10 mgのタンパクを流す。

Running gelは12%、stacking gel は7.5%で泳動する(分子量33 kDa)。

泳動後、メンブレンにトランスファーし、ブロッキングの後washし、一次抗体でブロットする(4℃、overnight)。

TBST bufferで10 min x 3 washした後、二次抗体に浸す(4℃、1時間)。

ECLを1枚のメンブレンにつき、1 mlを滴下し、フィルターに貼り付ける。

暗室にて自動現像機を用いて感光させる。