TOP>融合研究コース 平成17年度 研究報告
 

タンデム型Mannich-oxidation反応
を利用したTaxol誘導体合成

薬品動態制御学分野 勝見 英正

研 究 指 導 主 任 : 薬品動態制御学分野 教授 橋田   充

研究指導協力者 : 製剤機能解析学分野 教授 半田 哲郎

研究内容

研究計画

 一酸化炭素(NO)は、血管弛緩因子としてのみならず、活性酸素産生や血小板の凝集、免疫系の活性化などを制御する細胞間の情報伝達物質として機能し、生体におけるホメオスタシス維持に多彩な役割を果たしていることが明らかになってきた。近年、循環器疾患や虚血・再潅流時における内因性NOレベルの低下が、病態の悪化や合併症の発症と密接に関連することも示されてきた。したがって、NOを医薬品として体外から投与することは、このような疾患や障害に対する有効な治療法として期待される。しかしながら、NOは非常に不安定な化合物であり、投与に際しては生体内でNOを放出するNO供与体が必須である。また、NOは反応性が非常に高く、高濃度NOは組織障害を惹起するため、NOを利用した有効かつ安全な循環器疾患に対する治療戦略を立てるためには、NO供与体の体内動態を精密に制御し、NOを必要とする疾患部位へ選択的にデリバリーすることが不可欠である。そこで、本研究では、NOによる効果的な活性酸素障害の抑制を目的として、種々の化学修飾により機能性分子を付与したNOキャリアを創製し、その有効性を物性、体内動態、治療効果の観点から総合的に評価する。申請者が所属する研究室では、これまでにタンパク質の化学修飾およびそれに基づく体内動態制御について豊富な経験を有しており、実験動物を使った in vivo 分布実験から培養細胞系における in vitro 実験を遣ってドラッグデリバリーシステム(DDS)の機能評価を行ってきた。DDSにおいてはDDSキャリアと生体膜に存在する標的分子との相互作用がその効率を決定する重要な要因であり、論理的にキャリア分子を設計するためには相互作用の分子機構を解明することが重要である。しかしながら、当研究室には分子論的な相互作用に関する知識や技術がほとんどなく、物理化学を専門とするエキスパートとの共同研究が不可欠である。

 本研究を遂行するにあたって、まず高分子化NO供与体の合成を行う。種々の化学修飾を施すのに適したキャリアとして牛血清アルブミン(BSA)を選択する。BSAにNOを結合させるために、BSAに
N-succinimidyl S-acetylthioacetateを結合させて遊離SH基を導入し、NaNo2 あるいはisoamylnitriteと反応させる。NOの放出速度をコントロールするために、BSAにpolyethylene 修飾を施した誘導体も併せて合成し、同様のNO導入を行う。その他、標的細胞に選択的にNO供与体をデリバリーするために、糖修飾を施した誘導体を合成する。得られたNO供与体からのNO放出に関しては、in vitro 実験で緩衝液中の、in vivo 実験では血漿中のNO酸化物濃度をGriess法により評価する。In vivo 分布実験では111In標識した各BSA誘導体静脈内投与後経時的に血液および組織中の放射活性を測定する。治療実験においては、マウスを麻酔下門脈および肝動脈を一定時間閉塞してから再潅流する肝虚血再潅流障害モデルを用いて、障害のサロゲートマーカーとして肝臓から放出されるGOT,GPT活性を測定する。一方、糖修飾を施したBSA誘導体と生体膜上の糖認識レセプターとの相互作用解析では、肝臓よりアフィニティカラムにより精製レセプターをリポソームに分散した系を構築し、BSA誘導体との相互作用を表面プラズモン共鳴法および蛍光共鳴エネルギー移動法によって解析する。

 本解析により、リガンドと糖認識レセプターとの相互作用の様式、ならびにそれに対するPEG修飾の影響について分子レベルで明らかにになるもとのと期待される。これは、NO供与体を最適に分子設計するための基礎的知見を与えるとともに、本解析手法を確立し、応用展開することによってDDS評価の新しい道を拓くものと期待される。

Mechanism of hepatic ischemia/reperfusion injury

Biological activity and therapeutic use of nitric oxide

Design of novel NO donors with S-nitrosothiols

方法(Methods)

  • Number of NO adducts on NO donors.
  • The number of NO adducts on NO donors was determined by Saville assay. In brief, a solution of NO donors was mixed with 0.5 % ammonium sulfamate in 0.4 M HCl (total volume of 80 µl ) for 1 min to remove existing NO2 and HNO2 from the solution. Eighty µl 0.4 M HCl solution containing 3 % sulfanilamide and 0.25 % HgCl2 was added, followed by the addition of 80 µl 0.1 % N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride in 0.4 M HCl. To determine the number of S-nitrosothiol groups on NO donors, the mixture was incubated at room temperature for 10 min and the absorbance was read at 540 nm. Separately, to determine the number of total NO adducts on NO donors, the mixture was incubated for 5 h at room temperature, and then the absorbance was read at 540 nm. The number of NO adducts on NO donors was calculated according to a standard curve prepared with 2.5-100 µM NaNO2 (Fig.1).

  • In vitro production rate of NO oxidant from NO donors.
  • DAF-FM, fluorescence probe of NO oxidant, was dissolved in 0.1 M phosphate buffer solution containing 1 % bovine serum. Then, NO donors were added to the solution at 37 ゚C in the dark. The excitation wavelength was 485 nm and the emission was monitored at 535 nm (Fig.2).

  • Determination of NO2- derived from NO donors in mice.
  • Each NO donor was injected into the tail vein of mice at a dose of 1.5 µmol NO /kg. At appropriate times after injection, blood was collected from the vena cava under ether anesthesia, and the mice were then killed. Plasma was obtained from the blood by centrifugation. Plasma collected in a tube was centrifuged for 5 min at 4 ゚C. The ultrafiltrate was immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -30 ゚C until an assay for the nitrite (NO2-)levels, which was measured by an automated NO detector-HPLC system(Fig.3).

  • Tissue Distribution Experiment.
  • 111In labeled BSA and PEG-poly SATA-BSA were injected into the tail vein of mice at a dose of 1 mg/kg. At appropriate times after injection, blood was collected from the vena cava under ether anesthesia, and the mice were then killed. Plasma was obtained from the blood by centrifugation. The liver, kidney, spleen, heart and lung were removed, rinsed with saline, and weighed. Urine was also collected. The radioactivity in each sample was counted using a well-type NaI-scintillation counter (ARC-500, Aloka, Tokyo, Japan) (Fig.4).

  • Hepatic ischemia/reperfusion Experiment.
  • An incision was made in the abdomen, and the portal vein and the hepatic artery were occluded with a vascular clamp for 15 min to induce hepatic ischemia. Then, blood was allowed to reflow through the liver (reperfusion). The elevation of plasma glutamic pyruvic transaminase (GPT) and glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) levels were assayed after 6hr of reperfusion, as indicators of hepatocyte injury. Saline, SNAP, NO-BSA, PEG-poly SNO-BSA, and Man-poly SNO-BSA (2µmol NO/kg) were given via the tail vein just before reperfusion was initiated (Fig.5).

  • Evaluation of Neutrophil Infiltration.
  • Liver tissues were excised after 6hr of reperfusion to make the sections, and neutrophils in the liver section were stained using the AS-D chloroacetate esterase technique. Neutrophils were identified by positive staining and morphology and were counted in 25 high-power fields (HPF) (400) using a microscope. Only those neutrophils were counted that were present within sinusoids or extravasated into the tissue, those in large hepatic vessels such as venules were not(Fig.6).

研究状況報告

 近年、狭心症や高血圧症、動脈硬化症、糖尿病などの循環器疾患や虚血・再灌流障害時にNOの産生が減少することが示され、このNOレベルの低下が病態の悪化や合併症の発症と関連することが明らかにされた。従って、これら疾患・障害に対する有効な治療法の一つとしてNO供与体の投与が考えられ、これまでにも様々なNO供与体が開発され、そのいくつかは疾患治療上重要な医薬品として臨床使用されてきた。しかしながら、代表的なNO供与体である nitroglycerin や sodium nitroprusside は、それぞれ長期投与による耐性の獲得の問題やシアン中毒の危険性が指摘されている。S-nitrosothiol は活性酸素産生や耐性を生じない安全性の高いNO供与体として近年注目を集めており、その循環器疾患・障害治療への応用が期待される。しかしながら、SNAPや S-nitrosoglutathione などの既存の低分子 S-nitrosothiol の場合、静脈内投与後の体内からの消失うあNO放出が早く、治療に必要な量のNO惹起する。従って、S-nitrosothiol を利用したNOによる治療を最適化するには、S-nitrosothiol からのNO放出速度や体内動態を制御し、疾患部位に効率よくNOをデリバリーさせるDDSの開発が必須であると考えられる。そこで本研究では、NOに徐放化、あるいは肝臓へのターゲティングを可能にする新規高分子型S-nitrosothiol を開発し、肝臓虚血再潅流障害の抑制を試みた。

 NOの徐放化と血管内局在化を目的に ppolyethylene glycol(PEG)修飾BSAを合成した。別途、糖レセプターを利用した肝臓ターゲティングを目的に、mannose修飾BSAを合成した。各誘導体にN-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA)を結合することで遊離SH基を導入し(PEG-poly SATA-BSA)、亜硝酸と反応させることによりPEG-poly SNO-BSA、Man-poly SNO-BSAを得た。BSA一分子あたりNO導入数は約10個であり、多数のNOを導入することに成功した。(Fig.1)

Fig 1. Physicochemical characteristic of NO donors

 PEG-poly SNO-BSAからのNOの放出は緩衝液中、マウス静脈内投与後の血漿中いずれにおいても既存のS-nitrosothiol(SNAP、NO-BSA)と比較して著しく遅延し、PEG化によるNO徐放化が実現された(Fig.2-3)

Fig 2. NO release from NO donors
in 0.1 M phosphate buffer
solution containing 1 % serum at 37゚C
Fig 3. Determination of plasma concentration of NO2- derived
from NO donors after intravenous injection in mice

Each NO donor was injected into the tail vein of mice at a dose of 1.5 µmol NO/kg.The nitrite (NO2-) levels were measured by an automated NO detector-HPLC system.

 さらに、PEG-poly SNO-BSAのキャリア部分であるPEG-poly SATA-BSAはマウス静脈内投与後、BSAと比較して顕著に高い血中滞留性を示したことから、PEG-poly SNO-BSAは循環血中で持続的なNOデリバリーが可能であることが示された(Fig.4)。一方、Man-poly SNO-BSAのキャリア部分であるMan-poly SATA-BSAは急速に肝臓へ移行した(Fig.4)。

Fig 4. Tissue distribution of 111In labeled PEG-poly SATA-BSA Man-poly SATA-BSA after intravenous injection in mice

PEG-poly SATA-BSA(carrier part of PPSB) Man-poly SATA-BSA(carrier part of MPSB)

Protocol for in vivo hepatic ischemia/reperfusion experiment in mice

 これら特徴的な体内動態特性を有する高分子型 S-nitrosothiol は、NO産生減少が関与する種々の循環器疾患への利用が可能と考えられる。
そこで、肝臓虚血・再潅流障害に対する保護効果について検討を行ったところ、SNAPやNO-BSAと比較して血漿中GOT・GPT活性の上昇ならびに好中球遊走はPEG-poly SNO-BSAと肝臓ターゲティングが可能なMan-poly SNO-BSAの有用性が示された(Fig.5-6)。

Fig 5. Effect of NO donors on plasma GPT and GOT levels in mice after hepatic ischemia/reperfusion

6hr after reperfusion

Fig 6. Number of neutrophils in liver sections of mice after hepatic ischemia/reperfusion

6hr after reperfusion

 
 
 
 
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