Solution I (mM)
140 NaCl, 5 KCl, 2.5 sodium phosphate buffer, 10 HEPES, 6 glucose, 0.2 EGTA
(pH 7.4 with NaOH)
Solution II (mM)
140 NaCl, 5 KCl, 2.5 sodium phosphate buffer, 10 HEPES,
2 CaCl2, 1.3 MgSO4 (pH 7.4 with NaOH)
Elastase solution? Solution II + 30 units/ml elastase
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マウスに約0.1 mlのバルビタールを腹腔内投与し、眠らせる。
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金属製のバットにマウスをガムテープで四肢を貼り付ける。
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腹部に切れ込みを入れ、毛と皮を分離する。
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縦にハサミを入れ、肋骨の下にある軟骨部分まで露出させる。(肝臓を傷つけないように気をつける)
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露出させた軟骨部分をクーパーで挟み、脇の方の肋骨を切り、そこから横隔膜を切り離す。
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逆側の肋骨の脇にも切れ込みを奥まで入れ、クーパーをマウスの頭の方に持っていき、心臓を露出させる。
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肝臓を手で全体的に下の方にやり、心臓及び肺を確実に露出させる。
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シリンジにsolution IIを10 ml入れ、針を先端に付ける。
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針を右心室に刺し、右心房を切る。
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すぐにシリンジよりsolution IIを灌流させる
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肺が真っ白になったら器官、心臓及び肺を一括して切り離す。
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肺から心臓や器官、その他余分なものを取り除き、solution Iで8回、solution IIで2回洗浄する。
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elastase solutionに肺を入れ、37°C 20分間インキュベートする。
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肺を1 mm3片に細かく切り、DNase I を入れたelastase solutionに入れ、インキュベートする。
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elastaseの反応を止めるためにFBSを加える。
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遠心して細胞を沈殿させ、上清を吸って新しいsolution IIを加え懸濁させる。
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細胞懸濁液を100 mm、20 mm、10 mmのナイロンメッシュに通し、single細胞のみを得る。
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得られたsingle細胞をFc受容体に対する抗体の結合したビーズカラムに通し、肺胞上皮II型細胞以外の細胞を除去する。
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遠心して細胞を沈殿させ、上清を吸ってDMEM(+FBS、ペニシリン、ストレプトマイシン)を加え、シャーレに撒く。
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1〜2日後に実験に使用する。
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