マウスを頚椎脱臼後、後肢を切り落とす。
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皮をはぎ、筋肉を露出させる。
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筋肉にくっついた毛を取り、軽く膜をはぐ。
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Total muscleとして大腿筋の一部を取る。エッペンに入れ、液体窒素へ。
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肢を裏側にしてピンでシャーレに止める。
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慎重に筋肉をはいでいき、ヒラメ筋(Soleus)を露出させ、腱から腱までを摘出する。
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両足のヒラメ筋を摘出しエッペンに入れた後、液体窒素へ。
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次は肢を表側にしてすねの筋肉を一枚はぐと、長指伸筋(Extensor digitorum
longus; EDL)を露出させる。
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腱から腱までを摘出する。両足をエッペンに入れ、液体窒素へ。
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摘出した筋肉の両足分をまとめて1つのエッペンチューブに入れ、重さの10倍量のhomogenize
buffer(protease inhibitor cocktail + PMSF + DTT 1 ml/ml)を加える(重さを量る際は、キムワイプで水分を吸い取り、あらかじめエッペンの重さを量っておいてから組織重量を測る)。
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Homogenize bufferを加えた後、ポッター型orテーパー型ホモジナイザーによりホモジナイズする。
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エッペンチューブに移し変え、8000 rpm 10 minで遠心する。
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上清を別のエッペンに移し、それを用いてウェスタンブロットを行う。
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Bradfoed法によるタンパク定量を行い、含有タンパク量を吸光度により測定する(検量線にはBSAを用いる)。
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タンパク定量後、2xsample buffer (レムリーbuffer)を等量加えてSDS-PAGEを行うが、1
wellにつき10 mgのタンパクを流す。
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Running gelは12%、stacking gel は7.5%で泳動する(分子量33
kDa)。
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泳動後、メンブレンにトランスファーし、ブロッキングの後washし、一次抗体でブロットする(4℃、overnight)。
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TBST bufferで10 min x 3 washした後、二次抗体に浸す(4℃、1時間)。
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ECLを1枚のメンブレンにつき、1 mlを滴下し、フィルターに貼り付ける。
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暗室にて自動現像機を用いて感光させる。