遺伝子治療・DNAワクチン療法の最適化を目指した
核酸医薬品開発
【研究背景】
生理活性タンパク質を遺伝子の形で投与する遺伝子治療は、難治性疾患に対する根治療法として期待されています。同様に、癌やウイルス感染、アレルギー疾患などに対しては、抗原タンパク質をコードする遺伝子を投与するDNAワクチン療法の開発が期待されています。こうした試みにおいては、遺伝子を標的細胞内に効率よく導入することが必須であり、これを実現するためにウイルス・非ウイルスベクターの開発が世界中で進められてきました。遺伝子導入効率に優れるウイルスベクターを用いた研究も広く行われていますが、死亡事故や白血病発症など、重大な有害事象が問題とされています。これに対し、プラスミド DNA(pDNA) を基本とする非ウイルスベクターは、安全性・汎用性の観点から有望視されていましたが、治療用遺伝子導入ベクターとしての開発には低い遺伝子発現効率の大幅な改善が必要とされてきました。近年、大容量のpDNA水溶液を急速に静脈内投与する「ハイドロダイナミクス法」や電気パルスなどの物理刺激を利用する方法などが開発され、非ウイルスベクターの遺伝子発現効率が改善され、治療に必要なレベルの遺伝子発現が得られるようになってきました。非ウイルスベクターによる遺伝子導入を有効な疾患治療法とするためには、ベクター・遺伝子の体内動態の最適化や産生タンパク質の動態制御など、多岐にわたる過程での改善が可能と考えられます。
【研究成果】
私たちはこれまでにpDNAを利用した遺伝子導入に関して、おもにマウスを用いたin vivoでの検討を進めてきました。大容量のnaked pDNA水溶液を急速に静脈内投与することで肝臓において高い遺伝子発現が得られるハイドロダイナミクス法に着目し、これまでにその特徴的な体内動態ならびに細胞内移行メカニズムを世界に先駆けて明らかにしました。この導入法の場合、一時的に細胞膜透過性が亢進し、pDNAに限らずタンパク質や微粒子が直接細胞質内に移行することを、マウスを用いた検討から示しています1, 2)。この方法を用いたインターフェロン遺伝子導入により高い抗腫瘍効果を得ることに成功しています3)。さらには、pDNA中のCpGモチーフを削減したプラスミドを開発し、遺伝子発現を持続化することで効果を増強しました4)。また、ハイドロダイナミクス法の原理を応用することで、筋肉細胞に対しても高効率に遺伝子をデリバリー可能な方法の開発にも成功し、ジストロフィン遺伝子導入による筋ジストロフィー治療についても検討しています5)。
一方、DNAワクチンによる抗腫瘍免疫の誘導を目的として細胞特異的なデリバリーを可能にする非ウイルスベクターの開発に成功し、抗原提示細胞を標的とした抗腫瘍免疫の誘導が可能であることを実証しています6, 7)。しかしながら、このような遺伝子デリバリーシステムは遺伝子導入・発現効率が非常に低く、このことがより有効なシステム開発を阻む要因であることも明らかとなりました。そこで、抗原を発現するpDNA投与による抗腫瘍免疫の誘導に関しては、導入効率が十分でないことを明らかにした抗原提示細胞への遺伝子導入のアプローチではなく、それ以外の細胞で発現させた抗原を抗原提示細胞にデリバリーすることに取り組んでいます。抗原提示細胞への「キャリア」には熱ショックタンパク質を選択し、これに抗原分子と動態制御機能を賦与した融合タンパク質を発現するpDNAを皮内投与することで、強力な細胞傷害性Tリンパ球の誘導が可能であることを実証しました。
以上のように、私たちは単に遺伝子導入効率を改善するだけでなく、遺伝子産物の分子設計から導入遺伝子の再活性化までを包括的に統御することによる遺伝子治療・DNAワクチン療法の最適化に取り組んできました。今後、①遺伝子産物（タンパク質）の分子設計（サイズや電荷、特異的機能分子の有無）、②プラスミドベクター設計・開発（プロモータの選択、サイズ・CpGモチーフ数の制御）、③ベクター投与方法の選択・最適化、④遺伝子発現再活性化機構の利用、に関して対象疾患・治療タンパク質毎にシステムの最適化を図り、有効な遺伝子治療・DNAワクチン療法を実現したいと考えています。
【参考文献】
1.
Hydrodynamic-based Procedure Invovlves
Transient Hyperpermeability in the Hepatic Cellular Membrane: Implication of a
Nonspecific Process in Efficient Intracellular Gene Delivery
Naoki Kobayashi, Makiya Nishikawa, Kazauhiro Hirata and Yoshinobu Takakura
J Gene Med. 2004 May;6 (5):584-92. Abstract (PubMed)
2.
Hepatic Delivery of Particulates in the
Submicron Range by a Hydrodynamic-based Procedure: Implications for Particulate
Gene Delivery Systems
Naoki Kobayashi, Kazuhiro Hirata, Shi Chen, Atsushi Kawase, Makiya Nishikawa
and Yoshinobu Takakura
J Gene Med. 2004 Apr;6 (4):455-63. Abstract (PubMed)
3.
Therapeutic Effect of intravenous interferon
gene delivery with naked plasmid DNA in murine metastasis models
Naoki Kobayashi, Takeshi Kuramoto, Shi Chen, Yoshihiko Watanabe and Yoshinobu
Takakura
Mol Ther. 2002 Dec;6 (6):737-44. Abstract (PubMed)
4.
Improved anti-cancer effect of interferon gene
transfer by sustained expression using CpG-reduced plasmid DNA
Hiroki Kawano, Makiya Nishikawa, Masaru Mitsui, Yuki Takahashi, Keiko Kako,
Kiyoshi Yamaoka, Yoshihiko Watanabe and Yoshinobu
Takakura
International journal of Cancer. 2007 Jul 15;121 (2):401-6. Abstract (PubMed)
5.
Restoration of dystrophin expression in mdx
mice by intravascular injection of naked DNA containing full-length dystrophin
cDNA.
Liang KW, Nishikawa M, Liu F, Sun B, Ye Q, Huang L
Gene Therapy. 2004 Jun;11 (11):901-8. Abstract (PubMed)
6.
Manipulation of local disposition and gene
expression characteristics of plasmid DNA following intramuscular
administration by complexation with cationic macromolecule
Atsushi Kawase, Naoki Kobayashi, Keiko Isaji, Makiya Nishikawa and Yoshinobu
Takakura
Int J Pharm. 2005 Apr 11;293 (1-2):291-301. Abstract (PubMed)
7.
Enhanced antigen-specific antibody production
following polyplex-based DNA vaccination via the intradermal route in mice
Atsushi Kawase, Keiko Isaji, Ayumi Yamaoka, Naoki Kobayashi, Makiya Nishikawa
and Yoshinobu Takakura
Vaccine. 2006 Jul 7;24 (27-28):5535-45. Abstract (PubMed)