ペルオキシソーム膜タンパク質輸送に関与する
Ｐｅｘ３ｐ，Ｐｅｘ１９ｐ，ＰＭＰの結合様式の解析

構造生物薬学分野　佐藤　康彦

研究内容

背景

　細胞内で合成される様々なタンパク質群が、その機能すべきオルガネラへと輸送されるメカニズムは生命科学における未解明の問題である。ペルキオシソームは、極長鎖脂肪酸の代謝などに関与するオルガネラであり、その形成異常は Zellweger 症候群などの重篤な疾患を引き起こすことが知られている。ペルキオシソームへのタンパク質輸送のうち、可溶性タンパク質については輸送シグナルが解明されているが、膜タンパク質の輸送についてはほとんど不明である。

単層の脂質二重膜で構成される 過酸化水素や、長鎖及び極長鎖脂肪酸の代謝を行う 構成タンパク質は小胞体を経由せずにペルオキシソームへ輸送される。 その輸送にはPEX遺伝子の産物Peroxin( Pex )が関与する。

　ペルキオシソーム膜タンパク質（ＰＭＰ）ペルキオシソームへの輸送には、ペルキオシン（通称Pex）タンパク質群のうち、Pex19p と Pex3p とが関与している。Pex19p は PMP 専用のシャペロンあるいは輸送キャリアであり、Pex3p は PMP-Pex19p 複合体の受容体であると考えられている。すなわち、PMP がペルキオシソーム選択的に輸送されるメカニズムには PMP-Pex19p、Pex19p-Pex3p の分子認識機構が重要な役割をしているものと考えられる。したがって、これらの詳細を明らかにするために、まず PMP、Pex19p、Pex3p の精製タンパク質を用いて、相互の結合のメカニズムを理解することが必要である。

PMP(ペルオキシソーム膜タンパク質)輸送機構モデル

目的

申請者は、これまでの研究で、ヒト Pex3p の細胞質露出領域の大量発現、及び精製法を確立した。さらに、これを用いて Pex3p が Pex19p のＮ末端側半分の領域に結合することを明らかにした。Pex19p は PMP と Pex3p とで結合部分を使い分けていることが示唆されている。しかし、その詳細な結合領域の区分、及び PMP と Pex3p それぞれに対する結合の強さは不明である。本研究では、 Pex19p とその部位欠失変異体を用いて、PMP、Pex3p それぞれに対する結合の結合解離の特徴を調べることにより三者の相互作用様式の解明を目指す。

方法

• Pex19p上のPex3p結合領域の検討

　これまでに Pex3p は Pex19p のＮ末端側半分の領域に結合されることが明らかとなっている。そこでさらに詳細な結合領域の検討を行う。Pex19p の部位欠失変異体と Pex3p との結合解離の特徴を蛍光測定法やＳＰＲ法（表面プラズモン共鳴解析法）によって解明する。

• Pex19上のPMP結合領域の検討

　遺伝子レベルの研究から、Pex19p と PMP との結合に必要なそれぞれの領域は推測されているものの、その直接の結合の詳細は明らかになっていない。本研究では PMP モデルペプチドや無細胞合成法によって調整した数種類の PMP を用いて Pex19p の部位欠失変異体との統合機能の検討を行う。また、Pichia pastoris を用いて発現精製した PMP22 を用いて、Pex19p との結合性を調べる。

【Pex3p細胞質側部分（34-373）発現精製法】

E.coli BL21(DE3) pET-16b/Pex3p(34-373)IPTG誘導後 18℃ で18時間培養 　　　　　　　 ↓ 菌体の超音波破砕粗抽出液を遠心分離　　　　　 >>> Lane 1 　　　　　　　 ↓ Ni-NTA アガロース精製イミダゾールにより溶出 >>> Lane 2 　　　　　　　 ↓ ゲル濾過クロマトグラフィーSuperdex200 16/60　>>> Lane 3

【Pex3p(34-373)-Pex19p結合の蛍光強度変化測定による検出】

【Pex19pの結合によるPex3p(34-373)の蛍光スペクトル変化】

【界面活性剤がPex3p(34-373) - Pex19p 間結合に及ぼす影響】

【塩濃度がPex3p(34-373) - Pex19p 間結合に及ぼす影響】

【Pex3p(34-373)変異体とPex19pの結合実験】

まとめ

　本研究では Pex3p の W104A 変異体は、Pex19p との結合力が弱くなることを明らかにした。また、Pex3p と Pex19p との結合には、Pex3p の W104 の側鎖が関与することが示唆された。

　本研究で得られた W104A 変異体は Pex19p との結合能を持たない、Pex3p のモデルとして利用できると考えられる。今後、これを用いた細胞生物学実験を行い、

1. PMP 輸送における Pex19p-Pex3p 結合の関わり
2. ペルキオシソーム形成過程に於ける Pex19p-Pex3p 結合の関わり

を検討する予定である。

期待される成果

　Pex19p が様々な PMP や Pex3p と結合するメカニズムの解明は PMP 輸送系を明らかにする上で、重要であると考えられている。Pex19p の結合相手に応じた領域の使い分けや、親和力のデータはそれを理解するための基礎的情報になるものと期待される。次年度以降は、これらの結果を基に構造生物学的なアプローチによって分子認識機構の構造基盤の解明が行なえるものと期待される。